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揭示大脑神经元调控恐惧记忆消除的冰山一角 ——inscopix神经元超微钙成像系统应用

发布时间: 2020/04/09浏览次数: 99

揭示大脑神经元调控恐惧记忆消除的冰山一角

——inscopix神经元超微钙成像系统应用

当人类遭遇自然界中的灾难或发生在亲人身上的不幸时,人们的内心会感受到巨大的恐惧。这种心理的应激创伤需要时间的平复和当事人的心理建设,才会慢慢克服,从而迎接新的生活。但人们在进行心理状态的恢复时,不同的人会表现出不同的恢复速度。有的人很快就能从打击中振作起来,重新迎接新的生活。有的人就很长时间走不出来,甚至伴随其一生。人们从各种方面对这种情况发生的原因进行探索,科学家从生物学的角度也对其进行了大量研究。

科学家之前已经对这种情况进行大量的研究。人类对恐惧的获得是通过对一些事情的经历从而形成一些条件发射,之后再次触发就会使人感受到恐惧。就像人类对恐惧的获得一样,恐惧的消除也是需要经历一种学习过程,通过这种学习,新习得的事物会形成新的反射从而抑制之前的由恐惧造成的条件反射。

最近,科学家在小鼠大脑中发现,一类神经元对恐惧的消除具有某种调节作用。

在之前的研究中,人们发现,在恐惧记忆的消除过程中,消除记忆训练的时间选择对消除恐惧记忆的效果有很显著的影响。如果在恐惧记忆形成之后,即时进行消除训练的话,消除的效果和在更迟一些的时间进行消除训练相比,效果明显不好。研究人员通过测量恐惧信号发出时,小鼠因恐惧而“定住”的时间长短判定恐惧消除的效果。

对于这种即时消除训练的效果不佳,科学家也进行了研究。有证据表明,去甲肾上腺素能和促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)都参与了即时消除缺陷背后的神经回路的调节,但是,参与到早先恐惧记忆中的神经元对即时消除缺陷的有什么贡献还不清楚。研究人员猜测在CeA中的表达CRF的神经元(CeA-CRF neuron),对这种即时消除恐惧记忆时的缺陷有调节作用。

为了知晓小鼠神经结构上的先天因素,对小鼠的大脑进行了植入式的神经钙活动成像实验。在实验全程进行信号记录观察,所用的仪器是格罗贝尔为中国授权代理inscopix公司的nVista&nVoke微型显微成像设备。这个设备可以在小鼠进行行为学实验及自由活动期间对其大脑内的神经钙活动信号进行实时观察及记录。整个显微镜埋植在小鼠头骨上,由一根自聚焦透镜深入脑内部,根据透镜长度可以进行表面大脑皮层的观察和深部脑区如海马,纹状体等的观察。透镜有0.5mm0.6mm1mm直径的选择,整个透镜重约2克,小鼠完全可以在清醒状态下进行各种自由行为活动。根据调整内部液体透镜的电子对焦,其焦平面变化可变范围达300微米,借助钙指示病毒表达的绿色荧光蛋白可以清晰显示神经元胞体、轴突的脉冲式钙活动,反映神经环路中的具体实时活动。

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研究人员利用突触阻断剂将实验小鼠CeA-CRF神经元的功能阻断。在之后进行的即时消除和延迟消除实验中,实验组小鼠的恐惧消除在即时和延迟消除中均得到极为显著的效果,对照组则在即时消除中没有明显改变,在延迟消除中也没有得到像实验组即时消除的显著性(图1)。

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(图1

而对于其中小鼠CeA-CRF神经元表达的CRF的调控作用,研究人员在转基因小鼠中,利用注射带有Cre基因的病毒的策略,将小鼠神经元中的CRF基因敲除掉,之后进行即时消除和延迟消除的实验。发现在恐惧测量中,和对照相比,CRF敲除的小鼠“定住”的情况明显减少,小鼠恐惧程度显著减轻了(图2)。

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(图2

两个实验说明CeA-CRF神经元对恐惧的消除有确实的调控作用,而调控作用如前人研究所述,有其表达的CRF参与。

为了得到这一逻辑的必要性,研究人员对采用DREADD操纵CeA-CRF神经元的抑制和兴奋,通过分别注射特定的抑制型受体和兴奋型受体,然后药物处理使其神经元达到抑制和兴奋的目的。实验发现,在神经元受到抑制的情况下,即时消除也能得到极好的恐惧消除效果。而相反的,在神经元兴奋的情况下,延迟消除也不能有效的去除小鼠的恐惧状态(图3)。

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(图3

前面的方法是通过传统的实验方法进行研究的,而现在有了钙活动成像的技术,可以在单个神经元水平上,直观的观察到神经元的活动,并且通过神经元钙活动成像与行为学实验结合,可以研究神经元活动与动物行为之间的直接相关性,为研究功能性的脑神经活动提供了绝佳的技术工具。

研究人员将Cre依赖的编码钙指示蛋白基因的AAV病毒注射进CRF-Cre小鼠的CeA区域,这样就标记了该区域的CeA-CRF神经元,之后在与先前相同的小鼠行为实验的适应期,恐惧获得期,恐惧消除期,恐惧唤起期,4个区间观察小鼠CeA的神经元钙活动并记录其活动信号。在实验记录和后面的分析中发现,在恐惧消除和恐惧唤起两个区间里,即时和延迟的钙活动强度之间有显著性的差别。并且在这两个时期可以较准确的识别出细胞状态(图4)。

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(图4

将实验中记录到的神经元在4个实验区间内的钙活动信号按时间进行纵向的分析,可以观察到,在前期记录到有钙活动的神经元随着实验的进行,活动神经元数量不断减少,钙活动强度也会变化。在即时消除组的消除期间,钙活动强度没有显著降低,但在延迟组的消除期钙活动强度显著减低。在条件反射唤回恐惧时,即时组的钙活动强度有响应性的增强,而延迟组的钙活动强度增强不明显(图5)。

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(图5

而在之后通过光遗传的方法直接抑制CeA-CRF神经元的活动,实验组小鼠与对照组相比,“定住”更少,害怕的程度更小了(图6)。

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(图6

而通过光遗传方法激活CeA-CRF神经元,则小鼠在恐惧获得后即便在经过24小时的平复,再次消除之后,恐惧唤回时的恐惧水平依然很高(图7)。

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(图7

实验结果充分的证明了CeA-CRF神经元对恐惧消除的关键性调控作用。钙活动成像技术在阐明单个神经元与小鼠行为学表现之间的直接关系上,更加的直观和有说服力。

研究结果证明了在小鼠体内有特定神经元调控着恐惧记忆的消除,并且这些神经元的活动与恐惧消除的效果直接相关。可以猜测,人体内也有相似的机制控制着人类对创伤恐惧记忆的遗忘,遗忘的不同表现或许是出于先天。


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